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基因克隆

一.目的基因的獲得

目的基因是指所要研究或應用的基因,也就是將要克隆或表達的基因。獲得目的基因是分子克隆過(guò)程中重要的一步。目前用于獲得目的基因的方法有幾種，如限制性?xún)惹忻钢苯臃蛛x法、文庫篩選法、體外擴增法和人工合成法等，其中限制性?xún)惹忻阜ㄖ苯臃蛛x目的基因和多聚酶鏈式反應(PCR) 或逆轉錄多聚酶鏈式反應(RT-PCR) 體外擴增目的DNA--片段是目前常用的方法。

(一)采用限制性酶切法直接分離目的基因

1、從原核基因組中制備原核基因組相對較小，用幾種限制性?xún)惹忻阜謩e消化原核基因組，或用某種限制性?xún)惹忻笇λ芯康幕蚪M進(jìn)行部分消化，可以得到大小不等的各種片段，其中有些片段就會(huì )含有目的基因，將這些片段插入載體中進(jìn)行克隆，經(jīng)過(guò)篩選，可以得到所需的目的基因。

2.從真核基因組中制備真核基因組比較大，直接用限制性?xún)惹忻赶笮枰Y選的克隆數太多，不易操作。可以用一種限制性?xún)惹忻赶认蚪MDNA,產(chǎn)生連續的DNA--片段，然后電泳分離這些DNA--片段，再用-段特異探針與這些DNA--片段進(jìn)行雜交，在含有特異性模板的區域就會(huì )出現雜交帶，可以初步鑒定基因組中是否含有目的基因。我們也可以將酶切后的基因組DNA--片段全部克隆入適當的載體中，制成基因組文庫，再用特異性探針與基因組文庫中的不同克隆進(jìn)行雜交，陽(yáng)性克隆即示克隆到的DNA--片段含有特異基因序列。將陽(yáng)性克隆測序，用第--個(gè)克隆片段的末端分離下一個(gè)克隆片段，然后利用DNA--片段間的重疊順序來(lái)鑒定其他克隆。這樣一步步走下去，終可得全部基因序列，這種技術(shù)叫做染色體步移(chromosome walking)。

(二)采用PCR或RT-PCR方法制備目的基因

1.根據已發(fā)表的基因序列設計并合成引物，采用PCR (以基因組DNA為模板)或RT-PCR (以mRNA為模板)從組織或細胞中獲取目的基因片段用于基因操作，這是實(shí)驗室中常用的獲取已知基因的方法。

2.利用PCR獲取目的基因的一大優(yōu)點(diǎn)就是可以根據需要在引物序列上設計適當的酶切位點(diǎn)起始密碼子或終止密碼子等，或通過(guò)人為錯配改變堿基序列(人工突變)對目的基因進(jìn)行有限修飾。對于未知基因，可采取構建RT-PCR文庫的方法獲得未知基因:利用mRNA末端poly A序列尾設計共用引物，將所有mRNA逆轉錄成cDNA.利用各種工具酶在cDNA末端加尾,然后采用一對共用引物擴增所有cDNA--片段，將經(jīng)PCR擴增后的片段插入到適當載體中，構建成PCR-CDNA文庫。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可以將表達水平很低的mRNA擴增出來(lái)，有利于篩選出表達豐度低的基因。由于經(jīng)過(guò)PCR擴增，基因序列的精que確性需要采用其他方法進(jìn)一步確定。

3.還有一個(gè)獲得目的基因的方法是利用計算機技術(shù)進(jìn)行計算機克隆。即利用GenBank中的基因信息，通過(guò)軟件比較不同種屬基因之間的相似性(同源性)，利用保守區序列設計引物， 再用PCR或RT-PCR從不同種屬或不同組織細胞中獲取未知的基因片段。這是目前可實(shí)現的一種獲得新基因的捷徑。

(三)基因組文庫或cDNA文庫的構建和篩選

1.將基因組DNA用限制性?xún)惹忻赶蟛迦氲竭m當載體中，得到含有不同插入片段的克隆載體，這種克隆載體的混合物含有長(cháng)短不同的基因組片段，這就是基因文庫。若將細胞內所有mRNA均逆轉錄成cDNA,然后將所有cDNA--片段克隆到適當的載體中，構建成含有不同cDNA--片段的克隆載體混合物，這就是cDNA文庫。目前許多組織或細胞的基因組或cDNA文庫都可以從商業(yè)公司買(mǎi)到。

2.當獲得了基因組文庫或cDNA文庫，可以根據已知的信息合成特異性探針，采用核酸分子雜交的方法從文庫中篩選感興趣的基因片段，這仍是目前獲得新基因的一種常用手段。基因組文庫或cDNA文庫的構建和使用請參見(jiàn)本書(shū)相應的章節。

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